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人胚胎干细胞系:衍生与培养实验

2019-03-19人阅读

实验步骤
方 案 2. 6 人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立
 
试剂与材料
 
无菌或无菌制备
 
□ 5〜6 天的人胚泡,经 H F E A 允许,并且像先前讨论的完全经病人同意。 HFEA所要求的全部细节能够在 H E F A 的网站找到(http//:www.hfea.g0v.uk)。
 
□链霉蛋白酶, 0 . 5 % ,溶 于 DMEM
 
□ 抗 人 抗 体 , 3 0 % 〜5 0 %
 
□含有 Glutamax 的 DMEM
 
□ h E S 培 养 基(见 2. 2. 1 节)
 
□豚鼠的补体,用 DMEM I : 1 稀释
 
□ 4 孔培养板的每个孔以 7.5X 104 的细胞数接种新的失活的 M EFs,含 有 500ulHES 培养基
 
□大孔吸管
 
步骤
 
(a) 使胚胎生长到胚泡阶段,通常大约 5 天。
 
(b) 如果胚胎没有从透明圈里孵出,用 5〜IOuI 的 0 . 5 % 链霉蛋白酶在 37°C 孵育直到透明圈溶解。
 
(c) 将无透明圈的胚泡与抗人抗体孵育 i 〇 min,此抗体用含Glutamax 的 DMEM稀 释 3 0 % 〜5 0 % 。
 
(d) 在孵育之后,用 h E S 培养基短暂地冲洗胚泡使抗人抗体失活。
 
(e) 用 5〜IOmI 2 0 % 的豚鼠补体与胚泡在 37T:孵 育 5〜15 min, 目的是溶解胚胎滋养层,此时用大孔吸管轻轻吹吸胚胎将有助于溶解过程。
 
(f) 当胚胎滋养层完全溶解,用吸管轻轻地取出完整的内层细胞团并立即转移到含有 500ul h E S 培养基的 M E F s 培养板上。
 
(g) IC M 细 胞 2〜5 天内将贴壁,要每天观察细胞的生长。要在原位 停 留 1 5 天以上 ,如果需要,可以添加新的灭 活 的 MEFs (只有当集落大到足以传代时才能将它转到新 的 M E F s 培养板上)。
 
(h) 从 ICM 来源的细胞具有类干细胞的形态,通常出现在集落的中心。
 
(i) 当克隆达到约 0_1〜0.5 mm 大小时,用拉长的玻璃吸管将它们切割成 2〜10小块并转移到 2〜4 孔新的失活的 M E F s 培 养 板 中(见 方 案 2.7)。这个过程每 5〜7 天重复一次。
 
(j) 在新建立的 h E S 细胞系前几次传代之后, h E S 细胞的增殖就可按以下方案进行(见 2.5 节)。
 
注意: 一旦超过单一集落,初 建 的 h E S 细胞系的团块每一代都要冻存直到获得了大量冻存成功的冻存管(见 2 . 6 节)。 前 10〜1 5 代 最 少 5 0 % 的细胞将被冻存直到细胞系被很好的建立。
人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立
实验步骤
方 案 2. 6 人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立
 
试剂与材料
 
无菌或无菌制备
 
□ 5〜6 天的人胚泡,经 H F E A 允许,并且像先前讨论的完全经病人同意。 HFEA所要求的全部细节能够在 H E F A 的网站找到(http//:www.hfea.g0v.uk)。
 
□链霉蛋白酶, 0 . 5 % ,溶 于 DMEM
 
□ 抗 人 抗 体 , 3 0 % 〜5 0 %
 
□含有 Glutamax 的 DMEM
 
□ h E S 培 养 基(见 2. 2. 1 节)
 
□豚鼠的补体,用 DMEM I : 1 稀释
 
□ 4 孔培养板的每个孔以 7.5X 104 的细胞数接种新的失活的 M EFs,含 有 500ulHES 培养基
 
□大孔吸管
 
步骤
 
(a) 使胚胎生长到胚泡阶段,通常大约 5 天。
 
(b) 如果胚胎没有从透明圈里孵出,用 5〜IOuI 的 0 . 5 % 链霉蛋白酶在 37°C 孵育直到透明圈溶解。
 
(c) 将无透明圈的胚泡与抗人抗体孵育 i 〇 min,此抗体用含Glutamax 的 DMEM稀 释 3 0 % 〜5 0 % 。
 
(d) 在孵育之后,用 h E S 培养基短暂地冲洗胚泡使抗人抗体失活。
 
(e) 用 5〜IOmI 2 0 % 的豚鼠补体与胚泡在 37T:孵 育 5〜15 min, 目的是溶解胚胎滋养层,此时用大孔吸管轻轻吹吸胚胎将有助于溶解过程。
 
(f) 当胚胎滋养层完全溶解,用吸管轻轻地取出完整的内层细胞团并立即转移到含有 500ul h E S 培养基的 M E F s 培养板上。
 
(g) IC M 细 胞 2〜5 天内将贴壁,要每天观察细胞的生长。要在原位 停 留 1 5 天以上 ,如果需要,可以添加新的灭 活 的 MEFs (只有当集落大到足以传代时才能将它转到新 的 M E F s 培养板上)。
 
(h) 从 ICM 来源的细胞具有类干细胞的形态,通常出现在集落的中心。
 
(i) 当克隆达到约 0_1〜0.5 mm 大小时,用拉长的玻璃吸管将它们切割成 2〜10小块并转移到 2〜4 孔新的失活的 M E F s 培 养 板 中(见 方 案 2.7)。这个过程每 5〜7 天重复一次。
 
(j) 在新建立的 h E S 细胞系前几次传代之后, h E S 细胞的增殖就可按以下方案进行(见 2.5 节)。
 
注意: 一旦超过单一集落,初 建 的 h E S 细胞系的团块每一代都要冻存直到获得了大量冻存成功的冻存管(见 2 . 6 节)。 前 10〜1 5 代 最 少 5 0 % 的细胞将被冻存直到细胞系被很好的建立。
采 用 玻 璃 化 方 法 冻 存 h E S 细胞
 
实验步骤
方 案 2. 9 采 用 玻 璃 化 方 法 冻 存 h E S 细胞
 
试剂与材料
 
无菌或无菌制备
□ 生 长 于 M E F 饲养层之上的未分化的 h E S 细胞
 
□ hES-HEPES 培 养 基(见 2. 2. 2. 1 节)
 
□ 1 0 % 玻 璃 化 溶 液(见 2. 2. 2. 4 节)
 
□ 2 0 % 玻 璃 化 溶 液(见 2. 2. 2. 5 节)
 
□ 多 孔 板 , 4 孔(图 2.3a)
 
□开口拉长的玻璃化小管(图 2.3b )
 
□ 冷 冻 管 , 4. 5 ml
 
□ 拉 长 的 玻 璃 吸 管(见方案 2.7, h E S 细胞的手工传代)
 
□加样器枪头, 80M1
 
□ 配 有 大 孔 针 头(14 G) 的注射器
 
非无菌
 
□ 加 样 器 ,设 置 在 80W
 
□倒置解剖显微镜,有一个可加热至 37°C 的台子,放 在 II 级层流罩中。
 
□装满液氮的粗颈真空液氮罐
 
□长臂的镊子
 
□取液氮用的适宜安全设备
 
步骤
 
(a) 准备一个玻璃化板(见 图 2.3a)
 
孔 I : h E S - H E P S E 培养基, Im I
 
孔 2 : 空白
 
孔 3: 1 0 % 玻璃化溶液, Iml
 
孔 4: 2 0 % 玻璃化溶液, Iml
 
朝上的盖子: IOfd 2 0 % 玻璃化溶液
 
(b ) 使用前将板置于温箱中 2m i n ,预 温 。
 
(C) 将 h E S 细胞系的名称、代 数 、时 间 以 及 其 他 相 关 信 息 预 先 写 在 4.5 ml 冷冻管上。
 
(d ) 将大孔注射器针头放在燃气灯上小心加热,用 它 在 4. 5m l 冷冻管的顶部和底部戳一个洞,使液氮可以在管内自由流动,这有助于保持细胞在保存过程中一直是冷冻状态。
 
(e) 将 h E S 集落切割成小块,大小约两倍于传代所需的团块。小的集落团块经不住融化步骤,因此在大批冻存前,要测定每个 h E S 细胞系团块的大小是否正确。
 
(f) 将 6〜8 块集落小块转移至孔 1 中, 60s 。
 
(g ) 用加样器将所有集落小块从孔 1 转 至 孔 3 , 精确计时 60s
 
(h) 将集落小块从孔 3 转至 孔 4 , 精 确 计 时 30s。一定要精确计时,因为在非冷冻状 态 下 D M S O 溶液对细胞有毒性。
 
(i) 将集落小块转移至 I O p d 小滴中。
 
(j) 用一个加样器,在吸头的末端安上玻璃化小管(见 图 2.3b ) , 小心但迅速地将含有集落小块的溶液吸入。
 
(k ) 小心移去吸头,用一对长臂镊子将小管稍微倾斜浸人液氮,使细胞瞬间冷冻。
 
(l) 一 旦 冻 住(约 5〜10s) ,就将小管放入 4.5m l 冷冻管,再放回液氮中。
 
(m ) 当液氮充满冷冻管时,将存有小 管 的 4.5m l 冷冻管放入长期保存的液氮储存器中 ,用于日后复苏。
 
2.6.2 解冻 hE S 细胞
 
h E S 细胞的解冻速率具有很大可变性,因 此 最 好 是 「经验操作」,确定冻存集落的最适大小,获得解冻之后的最大的再生长。
 
方 案 2. 10 解 冻 玻 璃 化 冻 存 的 h E S 细胞
 
试剂与材料
 
无菌或无菌制备
 
□ —小管冷冻的 h E S 细胞集落小块,最好放在一个可移动的液氮容器内。
 
□ M E F 板(最好在用前失活处理 1〜3 天)
 
□ h E S - H E P E S 培 养 基(见 2. 2. 2. 1 节)
 
□ 蔗 糖 溶 液 , 0. I m o l / L (见 2. 2, 2. 3 节)
 
□ 蔗 糖 溶 液 , 0. 2m o l / L (见 2. 2. 2. 2 节
 
□ 多 孔 板 , 4 孔(图 2. 3a)
 
□ 80ul 加样器枪头
 
非无菌
 
□ 加 样 器 ,设 置 在 80ul
 
□倒置解剖显微镜,有一个可加热至 37°C 的台子,放 在 II级层流罩中。
 
□装满液氮的隔热容器
 
□长臂镊子
 
□取液氮用的适宜安全设备
 
步駿
 
(a) 如 图 2. 3 所示准备及预温解冻板:
孔 1,蔗糖 0.2molL ……………………………… Iml
 
孔 2 ,蔗糖, 0.lmolL ………………………….. Im I
 
7L 3 和孔 4, hES - HEPS培养基 ………….. …….1ml/孔
 
(b) 从长期液氮储存器中取一个冷冻管放入 一 个便携式液氮容器中。
 
(c) 用镊子取一个 h E S 细胞的小管,放入层流罩中。
 
(d) 快速操作,用手指压住小管的上端,将狭小的末端浸人含有0.2m 1/L 蔗糖的孔 1 中。
 
(e) 只要冻存物一融化,就要立 即 取 出 h E S 细 胞 团 块 放 至 蔗 糖 溶 液 中(用加样器排出所有剩余溶液)。
 
(f) 精确 孵 育 60s ,而后转入孔 2 (0. l m o l/L 蔗糖)中。
 
(g ) 在 孔 2 (0. l m o l/L 蔗糖)中孵育 60s。
 
(h ) 将细胞转移至孔 3 (h E S -H E P E S ), 5m i n 。
 
(i) 解冻的最后一个步骤,将细胞转移至孔 4, 5m i n 。
 
(j) 经过最后一个步骤之后,用加样器收集 h E S 细胞接种于 M E F s , 如 前 所 述(见方 案 2. 7)。
通 过 焚 光 免 疫 细 胞 化 学 分 析 h E S 细 胞 的 特 性
实验步骤
方 案 2. 11 通 过 焚 光 免 疫 细 胞 化 学 分 析 h E S 细 胞 的 特 性
 
试剂与材料
 
无菌或无菌制备
 
□ 生 长 于 0.1 % 明胶包被的玻璃盖玻片上的h E S 细胞
 
非无菌
 
□ 4 % 多聚甲醛
 
□ P B S A
 
□ T ris-缓 冲 盐 溶 液(T B S 一)
 
□含有 0.5 % T r i t o n X -100 的 Tris-缓 冲 盐 溶 液(T B S + )
 
□ 奶 粉 , 5 % W /V ,去 离 子 水(d H 20 ) 配制
 
□ 一抗; S S E A -1、 -3、 -4、 T R A -1-60、 -1-81 及 0 C T -4
 
□适宜的二抗
 
□ 封 片 剂 ,如 Fluorosave
 
□吸气器和吸液管
 
□铝箔
 
□纸板染色盘
 
□ 可 置 于 2 4 孔板的玻璃盖玻片
 
□ 平 板 摇 床(可选择)
 
□荧光显微镜和相机
 
步骤
 
第 1 天
 
(a) h E S 细胞可生长于M E F 伺养层细胞上一起染,因 为 M E F s 不会表达 任 何 hES细胞的标志物。一个24孔板要接种5 X IO5 个经丝裂霉素 C 灭 活 的 M E F s ,种 在 0.1 %明胶包被的13m m 玻璃盖玻片上,如 前 所 述(方 案 2. 5)。
 
(b ) 在固定之前, h E S 细胞最好要 传 代 至 有 M E F 细 胞 的 盖 玻 片 上 生 长 2〜3 天 ,以使细胞贴附并生长成单层,每一种抗体至少要用两孔h E S 细胞进行染色。
 
(c) 从生长着 h E S 细胞的盖玻片上吸去h E S 培养基,用 500W P B S A 洗一次。
 
(d ) 用 4 % 的多聚甲醒固定30 —— 4 0 m i n 。
 
(e) 吸去固定液,用 5 0 0 4 P B S A 洗一次。
 
(f) 每孔加 人 500f i l T B S + , 室 温 孵 育 15m i n , 最好放在平板摇床上摇,吸液时要小心 ,不要碰掉细胞。
 
(g ) 吸去 T B S + , 重 复 步 骤(f) 4〜5 遍 ,以保证细胞被彻底清洗。 T B S + 也使细胞渗透性增加,使抗体染色更充分。
 
(h ) 清洗结束时,用 500ul 溶 解 于 去 离 子 水 的 5 % 奶 粉 溶 液 孵 育 细 胞 30〜60m i n ,以阻断非特异性的抗体结合。
 
(i) 在此孵育过程中,根据供应商的提示,用 5 % 奶粉溶液稀释好一抗。
 
(j) 吸去奶粉溶液,重 复 洗 的 步 骤(f) 4〜5 次 ,已保证除去所有非特异性结合的抗体。
 
(k ) 每 孔 用 250〜500M 1相应的一抗 5 % 奶粉溶液孵育,室温过夜。最好放在平板摇床上摇,或者要确认细胞已被浸没。
 
注意:加液和吸液时要小心谨慎,以避免抗体的交叉污染。
 
第 2 天
 
(a) 吸去一抗溶液,每一种抗体用不同的吸头以避免交叉污染。
 
(b ) 用 T B S — 洗细胞,每 孔 500m 1。
 
(c) 用 T B S 醉育细胞,每 孔 500jlJ , 15m i n ,放在平板摇床上。
 
(d) 吸 去 T B S ‘ ,重 复 步 骤(c) 4〜5 遍 ,以保证除去一抗。
 
(e) 在清洗孵育过程中,可 用 TBS+ 配制相应 的 二 抗 ,每 孔 需 要 250〜 500ul抗体一T B S 1溶液 ,根据是否使用平板摇床来决定加的量(250ul 或 500ul)。
 
注意:如果使用 D N A 荧光染色显示核,要在这时阅读步驟(g )。
 
(f) 清洗结束时,吸 去 T B S - 溶 液 ,每 孔 加 250〜500ul抗体-T B S + 溶液孵育细胞,放在平板摇床上,室温孵育至少 l h 。
 
(g ) Hoechst 33258或 D A P I 可用于显示 h E S 细胞的核,可能要以适宜的浓度加人到二抗溶液中,可与二抗溶液一起孵育。
 
(h ) 用相应的封片剂封片,如 Fluorosave。
 
(i) 用荧光显微镜和照相设备观察之前,要让片子彻底干燥。
 
注意:所有 的 二 抗 以 及 用 二 抗 孵育的板都要用铝箔包 起 来 , 以 防 被 日 光 漂 白 。
 
方 案 2. 12 R T -P C R 合 成 h E S 细 胞 的 c D N A
 
试剂与材料
 
无菌或无菌制备
 
□ 几 小 块 h E S 细胞集落,按照与常规传代相同的方法制备(见 2. 5. 1. 2 节
 
非无菌
 
□ R N A 提取试剂盒,如 R N A e a s y
 
D 5 X A M V - R T Superscript e n z y m e
 
□ 缓 冲 液 :含 10m m o l / L M g C l 2 的 A M V - R T
 
□ 引 物 : oligo (d T )I8, 2ug/ul
 
□ 引 物 : oligjj C d N >i。, 2ug/ul
 
□ 核 苷 : d N T P s , 2m m o l / l
 
□核糖核酸酶抑制剂 : R N a s i n
 
□ 模 板 :提 取 的 R N A , 2ug
 
□ 无 R N A 酶的水
 
□ 设 置 在 70°C 的加热块
 
□ P C R 热循环仪
 
□加样器和吸头
 
□冰
 
步藤
 
(a) 使 用 R N A 提取试剂盒,按照制造商的说明书从 h E S 细胞制备 R N A 模板
 
(b ) 准 备 R T -P C R 的预混液:
 
d N T P s , 2m m o l / L 1ul
 
 
 
方 案 2. 13 通 过 P C R 分 析 h E S 细 胞 的 基 因 表 达
 
试剂与材料
 
无菌或无菌制备
 
□ 几 小 块 h E S 细胞集落,按照与常规传代相同的方法制备(见 2. 5. 1.2 节)。
 
非无菌
 
□10XTaq 缓冲液(标准液是 25 mmol/L MgCl2)
 
□ T a g D N A 多聚酶
 
□ d N T P s , 2m m o l / L
 
□ R T -P C R 合 成 的 c D N A 模板
 
□ 高 压 消 毒 的 d H 20
 
□琼脂粉
 
□溴化乙啶
 
□ 5 X 上样染料
 
i v ) 将一个梳子放人 P C R 胶的模具中,将热的混合物轻缓地灌人。注意不要产生气泡,因为气泡会妨碍 D N A 在胶中的迁移。
 
V) 拔 梳 前 置 室 温 30m i n , 使胶冷却直至凝同,放在电泳 槽 中 ,以 50m m o l / L溴化乙啶缓冲液覆盖之。
 
(d ) P C R 循环完成后,将样品从循环仪中取出。
 
(e) 每个样品中加 5M 1 上样染料,将样品加至胶中,确认同时加了 肌动蛋白阳性对照样品以及 D N A 梯形标准品。
 
(f) 开始电泳, 100V , 30〜40m m , 直 到 D N A 梯形标准品已经清楚地分开,在紫外灯下很容易区分。
 
(g ) 用 一 个 U V -透 视 器(波 长 315n m ) 看 胶 ,如果需要,用相机拍照。
 
(h ) 将每一个样品的所有 D N A 片 段 与 D N A 梯形标准品相比较,观察是否有预期的 带(前已述及),(3-肌动蛋白阳性对照样品也要被证实已经显示。
 
(i) 预期大小的 D N A 条带可以用洗胶试剂盒(如 G E N E C L E A N ® ) 很容易提取出来 ,并且应该通过测序来证实。